Antibioticumresistentie vormt een wereldwijd probleem. Indien we geen oplossing vinden, wordt geschat dat infectieziekten met antibioticumresistente micro-organismen tegen 2050 jaarlijks 10 miljoen doden zullen veroorzaken, wat hoger is dan het aantal sterfgevallen door kanker. Om deze evolutie een halt toe te roepen, is het belangrijk om de mechanismen te begrijpen die bijdragen tot de ontwikkeling van antibioticumresistentie.
Tot nog toe werd antibioticumresistentie voornamelijk bestudeerd aan de hand van geïsoleerde bacteriën. Vandaag weten we dat bacteriën geen geïsoleerde individuen zijn, maar voorkomen in dense, complexe gemeenschappen, die biofilmen genoemd worden. Deze biofilmen beïnvloeden mogelijks de ontwikkeling van antibioticumresistentie. Bacteriën in een biofilm zijn ingebed in zelfgeproduceerde slijmlagen, die de diffusie van antibiotica kunnen beperken waardoor ruimtelijke antibioticumgradiënten gevormd kunnen worden. Bacteriën in de binnenste lagen van de biofilm ondervinden zo een lagere antibioticumconcentratie en zouden gradueel resistentie kunnen verwerven tegen antibiotica door stapsgewijs naar de hogere antibioticumconcentraties in de buitenste biofilmlagen te migreren (Figuur 1A).
In deze masterproef werd daarom nagegaan wat de invloed is van antibioticumgradiënten in biofilmen op de ontwikkeling van antibioticumresistentie. Om dit te bestuderen werden de ruimtelijke antibioticumgradiënten in biofilmen nagebootst door tijdsafhankelijke gradiënten. Specifiek werden vijf parallelle populaties van Salmonella Typhimurium onderworpen aan vijf verschillende temporele gradiënten van het antibioticum cefotaxime. Voor elke gradiëntsterkte werd de antibioticumconcentratie dagelijks verhoogd met een vaste hoeveelheid tot een maximale antibioticumconcentratie (Cmax) die vier maal hoger is dan de concentratie waarop de bacteriën initieel konden groeien. De bekomen resistente populaties mimeren bacteriële populaties die de biofilmgradiënt van binnen naar buiten doorlopen tot Cmax bereikt wordt. Vervolgens verlaten deze bacteriën de biofilm via dispersie (situatie 1), of kunnen ze het oppervlak van de biofilm koloniseren in aanwezigheid van cefotaxime (situatie 2). Om deze tweede situatie na te bootsen werden alle populaties in het evolutie-experiment vervolgens blootgesteld aan Cmax tot dag 66 (Figuur 1B). De geëvolueerde populaties (situatie 1 en 2) werden geanalyseerd via resistentietesten en metagenoom sequentiëring.
In de eerste situatie bleken de populaties blootgesteld aan zwakke antibioticumgradiënten een hoger resistentieniveau te verwerven dan de populaties geëvolueerd in sterke antibioticumgradiënten (Figuur 1B). Bovendien wees analyse van individuele bacteriën uit de geëvolueerde populaties uit dat antibioticumresistentiemutaties in hoge frequenties aanwezig zijn doorheen de populaties. Over alle geëvolueerde populaties werden voornamelijk mutaties teruggevonden in antibioticumresistentiegerelateerde genen envZ, acrB en ramR. Opmerkelijk is dat enkel populaties geëvolueerd in de zwakkere antibioticumgradiënten mutaties bevatten in het doelwit van cefotaxime, PBP3, wat waarschijnlijk een verklaring biedt voor het hogere resistentieniveau van deze populaties. Studie van de tweede situatie wees uit dat het verschil in resistentieniveau ten gevolge van de gradiëntsterkte verdwijnt na een langere blootstelling aan Cmax (Figuur 1B). De eindpuntpopulaties zullen gesequentieerd worden om de mechanismen achter het gelijkgestelde resistentieniveau te bepalen.
Deze masterproef vervult een pioniersrol in de studie van antibioticumgradiënten en
resistentieontwikkeling. Het werk benadrukt niet alleen het effect van antibioticumgradiënten op de niveaus en mechanismen van resistentie, maar wijst ook op een wisselwerking tussen gradiënten en langdurige antibioticumbehandeling. De experimentele setup zal in de toekomst uitgebreid worden naar meer complexe ruimtelijke gradiënten.
Wil je Pauline aan het werk zien? Kom dan naar de finale van de VBI Student Research Awards op 10 oktober in de Aula van de 2e Hoofdwet in Leuven en help haar de hoofdprijs te bemachtigen! Meer info.